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Caractérisations biochimique et physiologique de nouvelles lignées d’orge résistantes au virus de la jaunisse nanisante

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R REKIK 1

F. CHIBANI 2

R. MZID 1

E. BABAY 1

M. HANANA 1

H. BEN GHANEM 3

A. NAJAR 3*

 

 

1 Laboratoire de Physiologie Moléculaire des Plantes (LPMP). Centre de Biotechnologie de Borj Cédria (CBBC). BP 901, Hammam-lif 2050, Tunisie.

2 Laboratoire des Plantes Extrémophiles (LPE). Centre de Biotechnologie de Borj Cédria (CBBC). BP 901, Hammam-lif 2050, Tunisie.

3 Institut National de la Recherche Agronomique de Tunisie (INRAT), Rue Hédi Karray, 2049 Ariana.

 

Abstract - Seaking for new varieties with high agronomical potential is a major concern for breeders. Practically, the introduction of a new variety at the farmer level requires germplasm evaluation in order to get the necessary informations about its identification. In this context, the aim of our study is to characterize using biochemical (protein and sugar contents) and physiological (behavior against salinity and drought) bases, describe and finally identify interesting barley lines, in comparison with two control varieties (Manel and Rihane). The analysis of the different studied parameters shows a significant diversity among lines, although they could be somehow very close within some characters. However, when considering the whole descriptive parameters, it appears that L6 line is highly performant at several levels including its soluble sugars (4 µg/mg MS), starch (143 µg/mg de MS), nitrogen and protein contents, but also its behavior with regard to salt and water stresses.

 

Keywords: Barley, Salt stress, Drought stress, Soluble sugar content, Starch, Germination, Hordein.

 

Résumé - La recherche de nouvelles variétés à haut potentiel agronomique constitue pour le sélectionneur une préoccupation constante. Dans la pratique, le lancement d’une variété à l’échelle de l’agriculteur nécessite un pré-requis d’évaluation du matériel génétique concerné afin de le doter de toute information qui puisse l’identifier. Dans ce contexte, l’objectif de notre étude consiste à caractériser sur des bases biochimiques (teneurs en protéines et sucres) et physiologiques (comportement vis-à-vis des stress salin et hydrique) de nouvelles lignées d’orge prometteuses issues d’un programme de sélection pour la résistance au virus de la jaunisse nanisante comparativement aux deux variétés témoins Manel et Rihane. L’analyse des différents paramètres évalués montre une diversité entre les lignées, bien que souvent très proches au niveau de certains caractères. En considérant les paramètres descriptifs dans leur globalité, il en ressort que la lignée L6 apparait performante sur plusieurs niveaux, notamment les teneurs en sucres solubles (4 µg/mg MS), en amidon (143 µg/mg de MS), en azote et en protéines, mais aussi par son comportement vis-à-vis des stress salin et hydrique.

 

Mots clés : Orge, Stress salin, Stress hydrique, Sucres solubles, Amidon, Hordéines.

 

1. Introduction

En Tunisie, l’orge (Hordeum vulgare L.) est la deuxième céréale cultivée (600000 ha) après le blé. Elle est réputée pour sa large adaptation à différents environnements tels que les régions arides et semi-arides (Abassi et al. 2012). Malgré l’importance économique de cette culture, plusieurs contraintes limitent son développement et sa productivité. En effet, en plein champ, l’orge est soumis à de nombreuses contraintes aussi bien biotiques (champignons, virus, viroïdes, bactéries et d’autres ravageurs) qu’abiotiques (salinité, sécheresse, températures extrêmes …) qui affectent évidemment sa production et sa qualité et constituent également un défi national pour atteindre la sécurité alimentaire. D’après l’Office National des Céréales, la Tunisie se voit dans l’obligation d’importer annuellement en moyenne 50000 mille tonnes d’orge fourragère destinées à l’alimentation animale (reference). Parmi les stress biotiques auxquels fait face cette culture figure le virus de la jaunisse nanisante de l’orge « Barley Yellow Dwarf Virus » (BYDV) qui est une maladie virale qui provoque des pertes de rendement considérables (Najar 2009). Le lancement de nouvelles variétés à haut potentiel agronomique constitue pour le sélectionneur une préoccupation constante et nécessite au préalable une caractérisation et une évaluation du matériel génétique. Dans ce contexte, les caractères morphologiques et physiologiques traditionnels pour la distinction génotypiques ne sont pas toujours suffisants. En effet, ils sont limités à certains stades de croissance de la plante et pourraient être affectés par l'environnement. Les marqueurs biochimiques tels que les isoenzymes, et les protéines (hordéines) pourraient être utilisés comme moyen efficace d'identification et de caractérisation variétale de l’orge. Ces techniques ont été utilisées également pour distinguer de nombreux génotypes d’orge canadienns, européens et marocains (Dakir et al. 2002, Dimova et al. 2010) mais aussi pour l’analyse de la diversité génétique et de l’étude de la phylogénie (Pomortsev et al. 2002). Les hordéines, protéines de réserve de l’orge, présentent la fraction azotée majeure de l’endosperme soit 35 à 55% de l’azote du grain mature en fonction du niveau de fertilisation azotée (Shewry et Miflin 1982). Elles sont particulièrement riches en proline et glutamine (Piston et al. 2005). Ces protéines sont primordiales pour déterminer la qualité nutritionnelle et fourragère de l’orge (Liu et al. 1996, Molina-Cano et al. 2002). L’objectif du présent travail est l’évaluation physiologique et la caractérisation biochimique de nouvelles lignées d’orge résistantes au BYDV et d’étudier leur comportement vis-à-vis des stress salin et hydrique comparativement aux variétés Manel et Rihane sensibles à ce virus.

 

2. Matériel et méthodes

2.1. Matériel végétal

Au cours de cet essai, le choix a été fixé sur cinq lignées d’orge résistant au BYDV (L1, L2, L3, L6, L7) et deux variétés communément cultivées Manel et Rihane utilisées comme témoins et connues pour leur sensibilité à ce virus (Najar 2009).

 

2.2. Extraction des sucres solubles et de l’amidon

Le dosage des sucres solubles est effectué selon la méthode de Dubois (1956). Les teneurs en sucres solubles sont déterminées en se référant à une courbe standard. Après cinq lavages du culot, l’acide perchlorique dilué (35 %) est utilisé pour la dispersion et l’hydrolyse de l’amidon en une seule étape et ce dernier est par la suite dosé par colorimétrie en présence d’anthrone sulfurique.

 

2.3. Dosage de l’azote et des protéines totales par la méthode de Kjeldahl

Le principe consiste à transformer la matière végétale en poudre fine homogénéisée après séchage, ensuite elle sera attaquée par l’acide sulfurique concentré en présence d’un catalyseur. La solution obtenue est alors distillée avec un excès de soude. Le distillat recueilli est titré avec une solution d’acide sulfurique N/100 (Kjeldahl 1883). La détermination de la teneur en azote total permet le calcul de la teneur en protéines, celle-ci est estimée en multipliant le résultat obtenu pour l’azote total par un facteur (5,7) (Williams et al. 1998).

 

2.4. Extraction des protéines de réserve

L’extraction des hordéines se fait suivant le protocole de Doll et Anderson (1980) en utilisant 100 mg de farine de graine d’orge décortiquée (3 graines d’un même épi). Le dosage des protéines extraites est fait selon la méthode de Bradford (1976).

 

2.5. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS

Nous avons utilisé la technique d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) pour séparer les protéines extraites selon la méthode de Laemmli (1970) modifiée.

 

2.6. Analyse des résultats et estimation du polymorhisme des hordéines

Les gels sont scannés par le système ChemiDoc™ MP (Biorad) (Bio-Rad versa DOC3000 gel imaging system) et seules les bandes nettement visibles sont comptabilisées. Les profils sont transformés en matrice binaire (présence (1) ou absence (0) de bandes) destinée à être analysée par le programme NTSYS 2.0 (Rohlf 1998), selon la méthode UPGMA (Unweighted Pair Group Method With Arithmetic Means).

 

2.7. Traitements salin (NaCl) et hydrique (PEG)

Après désinfection, les grains sont mis à germer dans des boites de Pétri sur deux papiers filtre stériles à raison de 10 grains par boite. Les boites sont placées dans un incubateur où la température est de 25 °C, l’humidité relative de 80 % et sous obscurité. Diverses concentrations de sel (0, 100 et 200 mM NaCl) sont appliquées sur ces grains pour assurer le stress salin. Quant au déficit hydrique, il a été induit par l’application de différents traitements de PEG 6000 préparés selon l’équation suivante :

Ψ = -(1,18*10-2) C – (1,18*10-4) C² + (2,67*10-4) CT + (8, 39*10-7) C²T

2.8. Analyses statistiques

Les résultats obtenus ont été soumis à une analyse de variance. Les valeurs moyennes sont comparées entre elles à l’aide du test Duncan (au seuil de probabilité alpha = 5%) en utilisant le logiciel GenStat, Release 7.2 - Discovery Edition 3 (Buysse et al. 2007). 

 

3. Résultats

3.1. Teneurs en sucres solubles et en amidon

Etant donné l’importance de ces composés glucidiques et leur accumulation au cours de la phase d’embryogenèse dans la graine, nous avons jugé essentiel d’analyser ces paramètres. Les résultats du dosage des sucres solubles montrent que la variété Rihane et la lignée L6 présentent les teneurs les plus élevées (4,36 et 4 µg/mg MS respectivement, sans différence significative) suivies par L2 et L1 alors que L7 présente la teneur la plus faible (2,36 µg/mg MS) (figure 1B). La lignée L6 présente aussi la teneur la plus élevée en amidon (143 µg/mg de MS) (bien que sans différence significative avec Rihane et Manel) et L1 présente la teneur la plus faible (107,7 µg/mg de MS), ce paramètre ne varie pas significativement entre les autres lignées (figure 1A).

 

Figure 1. Teneurs en sucres solubles (B) et en amidon (A) des différentes lignées et variétés d’orge étudiées.

 

3.2. Teneurs en azote total et en protéines

Le dosage en azote total montre une différence significative entre les différentes lignées étudiées (figure 2A). La lignée L1 présente la teneur la plus élevée en azote (1,66 %) et Rihane présente la teneur la plus faible (0,92 %). La teneur en azote des autres lignées est aux alentours de 1,1 et 1,2 %. De même, la lignée L1 affiche la meilleure teneur en protéines (9,49 %), alors que Rihane est la plus pauvre en protéines (5,29 %), les autres lignées restantes aux alentours de 6,5 et 7 %, avec L6 en deuxième position (figure 2B).

 

Figure 2. (A) Teneurs en azote (B) Teneurs en protéines et (C) Teneurs en hordéines des différentes lignées et variétés d’orge étudiées.

 

3.3 Analyse des hordéines par la technique de SDS-PAGE

3.3.1. Teneurs en hordéines

La teneur en hordéines des lignées varie significativement d’une lignée à une autre. En effet, la lignée L1, bien que ne différant pas significativement de L2, est la plus riche en hordéines (14,04 µg/mg MS). Les autres lignées présentent des teneurs allant de 9 à 12 µg/mg MS (figure 2C).

 

3.3.2. SDS-PAGE

La séparation par SDS-PAGE (15%) des protéines de réserves, extraites à partir des grains des différentes lignées et variétés d’orge, a permis de visualiser les 4 groupes d’hordéines (A, B, C et D), les hordéines A et D n’ont pas été prises en considération au cours de notre analyse afin d’atteindre une meilleure résolution des catégories B et C d’hordéines (figure 3A). En effet, la majeure partie des hordéines (80%) est formée par les fractions B et C (Salcedo et al. 1980, Pelger et al. 1993). les hordéines A ne sont pas considérées comme des réelles hordéines selon Miflin et Shewry (1982) et les hordéines D sont moins variables que les B et C. En total, 25 bandes de différentes tailles ont été révélées au niveau des grains des 7 lignées et variétés étudiées et dont le poids moléculaire varie de 27 à 90 kDa avec une moyenne de 9 bandes par lignée (au minimum 7 bandes pour L1 et au maximum 10 bandes pour les lignées L2, L6 et L7). L’analyse des hordéines montre un haut degré de polymorphisme, chaque lignée ou variété présente un profil propre à elle (figure 3B). Un total de 7 profils est ainsi observé. Des bandes spécifiques pour certaines lignées ont été détectées, notamment :

  • Une bande de taille 68 kDa chez Manel

  • Une bande de taille 78 kDa chez L1

  • Une bande de taille 63 kDa chez L2

  • Une bande de taille 49 kDa chez L3

  • Deux bandes de taille 65,5 et 59 kDa chez L7

  • Rihane et L6 ne présentent aucune bande spécifique.

Les profils électrophorétiques des hordéines des grains d’orge étudiés ont servi pour l’établissement d’un dendrogramme illustrant la relation phylogénétique entre les 7 lignées et variétés étudiées (figure 3C). En se situant à un niveau de similarité de 57 %, on obtient 2 groupes et 1 lignage indépendant a savoir le groupe A, représenté par Rihane, L1 et L2, le groupe B, regroupant Manel, L6 et L3 et la lignée L7, formant un singleton.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Figure 3. A. Profil électrophorétique SDS-PAGE des protéines de réserves des grains des 7 lignées et variétés d’orge étudiées (M = Marqueur moléculaire de poids). B. Représentation schématique des bandes des hordéines B et C de grains d’orge des 7 lignées et variétés étudiées.

C. Profils électrophorétiques par SDS-PAGE des 7 lignées et variétés étudiées.

 

3. 4. Evaluation de la tolérance à la salinité et au stress hydrique des lignées et variétés d’orge au stade germinatif

Les résultats illustrés au niveau de la figure 4A présentent une réponse phénotypique au stress salin au cours de la germination. Les doses de sel utilisées dans cette étude ont été fixées sur la base de la charge en NaCl des eaux de surface et d’irrigation en Tunisie et dans les zones de vocation fourragère qui ne dépasse pas 6 à 7 g/l (Hachicha et al. 1995). Nous avons donc choisi d’utiliser 2 doses en NaCl (100 et 200 mM). On remarque que la germination varie selon les lignées et les concentrations appliquées. En condition témoin (0 mM NaCl), le taux de germination dépasse les 90 % pour la plupart des lignées, ceux qui montrent les pourcentages les plus élevés sont Rihane, Manel et L3 (respectivement 96%, 93% et 90 % de grains germés) suivi des autres lignées qui affichent des pourcentages allant de 80 à 86%. Pour des concentrations de NaCl moyennement élevées (100 mM), la capacité germinative pour la plupart des génotypes n’est pas affectée et les valeurs enregistrées sont statistiquement proches des valeurs obtenus en condition témoins. Donc, 100 mM NaCl ne constitue ni une contrainte ni un stress ionique pour la germination de ces grains d’orge.

A 200 mM NaCl, toutes les lignées d’orge voient leur capacité germinative réduite exceptée la variété Rihane qui affiche un pourcentage de germination réduit de 6 % par rapport au témoin et de 3% par rapport à 100 mM, ce qui est considérable pour cette concentration de NaCl. La capacité germinative des lignées L3 et L6 a diminué à 200 mM quoiqu’elle reste encore supérieure à 50%. Les autres lignées sont sensibles à cette concentration de NaCl (entre 35 et 40% de germination).

Les résultats des essais de germination sous différents traitements en PEG montrent que la faculté germinative des grains est affectée par la contrainte hydrique (figure 4B). Le taux de germination moyen varie entre 87,3% pour le témoin et 33,3% pour le milieu le plus concentré en PEG. En condition témoin, Rihane, Manel et L3 montrent les pourcentages les plus élevés (96, 93 et 90 % respectivement). Les autres lignées présentent des taux moins élevés. Un léger déficit hydrique (Ψ = -3 bars) n’a pas de conséquences notables sur le taux germinatif des graines des lignées L1 et L7. Une concentration plus importante en PEG (Ψ = -6 bars) aboutit à une réduction de la capacité germinative de quelques lignées, notamment celles de Manel, L1, L3 et L6 qui diminuent de plus de 10 %. La lignée L7 présente une diminution importante du taux germinatif de 33 %, après avoir bien germée à Ψ = -3 bars. La variété Rihane ne présente aucune sensibilité à ce potentiel hydrique.