A+ A A-

La régénération et l’assainissement viral des agrumes en Tunisie par la technique du microgreffage des méristèmes «in vitro»

Attachments:
Download this file (JNS_AgriBiotech_Vol_12_2.pdf)Volume 12, Article 2[Volume 12, Article 2]542 kB

N. Metoui 1,

L. Hamrouni2*,

W. Ben Hbal3,

F. Dhaoudi1,

R. Ben Brahem4

T. Betaeib3

 

1 Centre Technique des Agrume (CTA), B.P.N°318, Zaoulett Jedidi 8099 - Tunisie

2 Laboratoire d’Ecologie Forestière, Institut National de Recherches en Génie Rural, Eaux et Forêts. BP 10, 2080 Ariana, Tunisia.

3 Institut National d’Agronomie de Tunis, 43, Avenue Charles Nicolle 1082 –Tunis Mahrajène - Tunisie

4 École supérieur des industries alimentaires de Tunis ESIAT, 43 Rue Charles Nicole -1082 Cité Mahrajène Le Belvédère Tunis-Tunisie.

 

Abstract - The micrografting is one of the techniques of vegetative propagation allowing getting authentic and virus free citrus. This technique is one of methods widely used in the scheme of certification of different country producing citrus. It allows getting of clonal buds or what we are calling pre basic material which serves in producing citrus certified “viruses Free”. Some trials have been established to improve the preservation of fruits and seeds of rootstock Citrange troyer used in vitro as well as the success rate and development of plugins. Indeed, tests of fungal treatment for three months have shown that the use of the fungicide "Triziman" is the most effective way with its highest protective effect, which has a lower percentage of infection (56%) compared to Methyl tiphanate and Benlate (respectively 75.7% 70.4%). Thus, and after five months of follow-up testing, we have shown that the nature and the tool of the average retention significantly affect seed germination percentage. Indeed, the seeds collected directly from fruits freshly harvested Citrange troyer ensure a higher percentage of germination of up to 100% compared to seeds treated and stored at 4°C with a germination rate does not exceed 29% and in some cases it decreases to 0%. Tests conducted on the effect of the variety on the success rate of tip grafting showed that the percentage obtained varies from one variety to another. Indeed, the Clémentinier arbi shows the percentage of success with the highest (19%), while the success rate is 13% for the Maltese and 9% for Clémentinier Cassar.

 

Keyswords : Citrange troyer, tip grafting, Citronnier arbi, Maltese, Clémentinier Cassar.

 

Résumé - Le microgreffage est une technique de multiplication végétative qui permet l’obtention de plants d’agrumes authentiques et sains. Cette technique est l’une des méthodes les plus utilisées dans les schémas de certification de différents pays producteurs d’agrumes. Elle permet l’obtention de têtes de clones ou ce qu’on appelle le matériel de pré base qui servira à son tour à produire des plants d’agrumes certifiés indemnes de maladies virales. Des essais ont été mis en place afin d’améliorer la conservation des fruits et des pépins du porte greffe Citrange troyer utilisé in vitro ainsi que le taux de réussite et le développement du greffons. En effet, des essais de traitement fongiques durant trois mois ont montrés que l’utilisation du fongicide «Triziman » constitue le moyen le plus efficace grâce à son effet protecteur le plus élevé qui présente un pourcentage d’infection inférieur (56%) par rapport au Méthyl-tiphanate au Benlate (respectivement 75,7% 70,4%). Ainsi, et après cinq mois de suivi des essais, nous avons pu montrer que la nature et l’outil du moyen de conservation des pépins influent considérablement le pourcentage de germination. En effet, les pépins prélevés directement à partir des fruits de Citrange troyer fraichement récoltés assurent un pourcentage de germination plus élevé qui peut atteindre 100% par rapport aux pépins traités et conservés à 4°C dont le taux de germination ne dépasse pas 29% et dans certaine cas il décroit jusqu’au 0%. Les essais menés sur l’effet de la variété sur le taux de réussite du microgreffage d’apex ont montré que le pourcentage obtenu varie d’une variété à autre. En effet, le Citronnier arbi présente le pourcentage de réussite le plus élevé avec (19%) alors que le taux de réussite est de 13% pour la Maltaise demi-sanguine et de 9% pour le Clémentinier Cassar.

Concernant l’origine des pousses, les essais ont montré que le taux de réussite de microgreffage dépend aussi de l’origine des pousses utilisées. Les résultats montrent que le pourcentage de réussite est plus élevé pour les pousses prélevées directement à partir des pieds mères élevés sous insect-proof par rapport à ceux prélevées sur des baguettes forcées in vitro sous condition artificielles.

 

Mots clés : Citrange troyer, microgreffage, Citronnier arbi, Maltaise demi sanguine, Clémentinier Cassar, apex.

 

  1. INTRODUCTION

Les Agrumes représentent la production fruitière la plus importante du monde et sont classés parmi les fruits les plus cultivés en Tunisie car ils occupent une place importante dans la vie socio-économique (Lakhoua, 1997). En effet, cette culture généralement intensive vient au deuxième rang après les oliviers. Elle fait intervenir 11.600 producteurs et permet un revenu stable à plus de 25.000 familles en plus de la main d’œuvre saisonnière estimée à 3 millions de journées de travail/an. La superficie est passée de 13.500 en 1990 à 25.000 ha en 2014 grâce à la création de nouvelles plantations dans de nouvelles zones (Gifruit, 2014) Cette dernière superficie représente environ 5% des plantations arboricoles.

En dépit de la tradition tunisienne de produire les agrumes, le secteur agrumicole continue à affronter certains problèmes aussi bien à l'échelle de la production qu'à l'échelle de la commercialisation, en particulier au niveau du marché d'exportation. En dépit de sa spécialisation dans la production d'oranges Maltaises, la Tunisie a vu diminuer les exportations de cette variété durant les deux dernières décennies. Elles sont passées de 31 005 tonnes en 1997 à 20 530 tonnes en 2013. Cette diminution des exportations est principalement due à différents facteurs dont le vieillissement d’un pourcentage élevé de pieds d’agrumes (30 %) principalement dans la région du cap bon, le manque de maitrise des techniques de tailles, de fertilisation et d’irrigation et surtout la difficulté de maitrise de l’état sanitaire et des maladies des vergers. En effet, Cette culture est l’objet de problèmes phytosanitaires, essentiellement du fait des insectes, des acariens, des ravageurs, des champignons, des bactéries et principalement des maladies virales et à virus similaires qui n’ont aucune possibilité de lutte chimique. Ces derniers causent des pertes économiques énormes. Cette conjoncture et ces défaillances impose la nécessité de mener des recherches concernant l'amélioration du paquet technologique en vue d'augmenter les rendements d'une part, et de prospecter de nouveaux débouchés sur des marchés alternatifs d'autre part. Avant 1975, le nucellaire était la seule méthode pour enrayer les viroïdes des agrumes. Cependant, il y avait beaucoup de problèmes associés à la technologie nucellaire principalement l’apparition et la persistance des caractères juvéniles des plantules régénérées. Depuis, des études préliminaires ont montré que les petits apex méristématiques (de 0,1 à 0,25 mm de longueur) appartenant à des cultures maraîchères pouvaient être cultivés dans des milieux de culture artificiels à base de gélose. Les travaux de Morel et Morin (1952) ont permis d’obtenir des plants de Dahlia exempts de virus à partir de culture d’apex en conditions aseptiques. Grâce à cette méthode plusieurs espèces non ligneuses comme la pomme de terre et le fraisier ont pu être régénérées. Quant aux espèces ligneuses, elle n’était pas efficace car le taux de survie des rameaux était faible. Ce sont les travaux de Navarro et al (1975, 1981) qui ont permis la régénération des Citrus par microgreffage d’apex. Le microgreffage est une approche qui permet de résoudre bon nombre de problèmes classiques tels que les incompatibilités greffons/porte-greffes, la sécrétion de substances phénoliques et de résine (Joley et Opitz, 1971 ; AI-Barazi et Schwabe, 1982 ; Sheibani et Villiers, 1995), les reprises lentes et aléatoires des greffons, entrainant une hétérogénéité des arbres greffés surtout lorsqu'il s'agit des porte-greffes issus de semis. Le microgreffage permet également d'augmenter la production par : (i) la production de plantes indemnes de virus (Navarro et al., 1975 ; Mosella- Chancel, 1979 ; Vogel et al., 1988 ; Barba, et al., 1989 ; Ben Abdallah et al., 1996) ou (i¡) pour la production de têtes de lignées ou de greffons sains utilisés pour la multiplication (Vogel et al., 1988). peut également être utilisé pour I'indexage (Bouzid, 1983 ; Tanne et al., 1993) et le contrôle précoce des incompatibilités au greffage (Jonard et al., 1988). Au cours du présent travail nous nous sommes proposé de donner un aperçu sur l’application de cette technique en Tunisie, et les principaux résultats obtenus. De même, nous tenté d’améliorer les résultats jusqu’alors obtenus par des essais mis en place touchants les étapes les plus importante de cette technique.

2. MATERIEL ET METHODES

2.1. Matériel végétal

Le matériel végétal utilisé pour les essais de micro-greffage des agrumes, est constitué du porte-greffe Citrange troyer issus de semis in vitro et de trois variétés d’agrumes jugées très importantes en Tunisie : Citronnier - Citronnier eurêka, Maltaise demi-sanguine, Clémentinier Cassar. Les explants des variétés testées sont représentés par des apex méristématiques prélevés à partir des pieds mères élevées sous serre insecte-proof ou bien à partir des baguettes forcées in vitro qui sont prélevées à partir des mêmes pieds mères atteints de psorose et mise en culture dans une chambre de culture sous des conditions artificielles.

 

2.2. Préparation du matériel végétal

Plusieurs facteurs ont été étudiés au cours de la techniques de microgreffage afin d’optimiser cette technique. A savoir :

  1. Effet de traitement fongique sur le taux de contamination du porte-greffe Citrange troyer

  2. Influence des conditions de conservation des semences de Citrange troyer sur le pouvoir germinatif

  3. Effet de l’origine des greffons prélevés sur le taux de réussite de microgreffage

  4. Effet de la variété sur le taux de réussite du microgreffage d’apex

2.2.1. Effet de traitement fongique sur le taux de contamination du porte-greffe Citrange troyer

Le matériel végétal utilisé pour le test du porte-greffe est constitué de de deux lots :

  • des fruits de Citrange troyer

  • des pépins de Citrange troyer décortiqués juste après la collecte des fruits

Les deux lots sont prélevés à partir des vergers appartiennent au parc semencier de centre technique des agrumes CTA. Ainsi e Traitement des fruits de Citrange troyer s’effectue à maturité juste après la récolte en utilisant trois types de fongicide afin d’éliminer toute sorte de contamination (Tab.1). Les fruites traités sont ensuite séchés à l’air libre.

Tableau 1 : Liste des différents fongicides utilisés dans le traitement des fruits de Citrange troyer

Nom commercial du fongicide

Benlate

Methylthiophanate

Triziman

  • Substance actif

Benomyl

Lagrophanate

Mancozèbe

  • Teneur

100g/hl

250g/hl

250g/hl

  • Formule chimique

C14H18N4O3

C12H14N4O4S2

(C4H6MnN2S4)x(Zn)y

 

Par ailleurs les pépins de Citrange troyer sont traités selon la méthode suivante : trempage dans l’eau Eau de javel 6° pendant 15mn, ensuite enrobage avec les trois types : Benlate, methylthiophanate et Triziman

2.2.2. Influence des conditions de conservation des semences de Citrange troyer sur le pouvoir germinatif

En vue de comparer l’effet des conditions de conservation des pépins du porte greffe Citrange troyer sur leur pouvoir germinatif nous avons testé deux origines des graines :

  • Lot1 : les pépins semés sont issus des fruits de « Citrange troyer » traité par un fongicide, séchés et conservés à 4°C.

  • Lot2 : les pépins semés sont des graines de « Citrange troyer » qui ont été traités auparavant par un fongicide et conservés à 4°C

Indépendamment de l’origine du porte-greffe (fruit ou pépins conservés), ils subissent les mêmes étapes de désinfection à savoir :

  • Décorticage des pépins et enlèvement des téguments externes et internes

  • Trempage dans de l’eau de javel 12° (50%) additionnée de tween 20 pendant 15mn

  • Rinçage (3 à 4 fois) à l’eau distillée stérile

Les pépins sont ensuite placés sur papier filtre stérile sous hotte a flux laminaire afin d’assurer leur séchage évitant ainsi le risque de développement des champignons saprophytes après leur mise en culture sur milieu de culture stérile. Après leur séchage les pépins stérile sont mis en culture dans des tubes à essais rempli de milieu de culture MS solidifié. Ces tubes dont placés à l’obscurité à une température de 27°C. Une fois germés les porte-greffes atteignent une taille de 4 à 5cm de hauteur et deviennent prêt au microgreffage in vitro.

 

2.2.3. Effet de l’origine des greffons prélevés sur le taux de réussite de microgreffage

Les greffons peuvent avoir deux origines :

  • Prélevés directement à partir des copies pieds mères : les pousses sont prélevées directement à partir des copies pieds mères élevés sous insecte proof. Ces pieds sont effeuilles deux semaines à l’avance afin de favoriser l’émission de nouvelles pousse. Cette opération ne peut se faire que durant les deux périodes de poussés végétatives des agrumes à savoir l’automne et principalement la période printanière.

  • Obtenus à partir de forçage in vitro : cette opération est réalisable tout au long de l’année. Il s’agit de prélever des baguettes a partir des pieds à assainir et de les forcer in vitro.

Ces baguettes sont tout d’abord désinfectées selon les étapes suivantes :

  • Désinfection superficielle par trempage dans un mélange d’eau de robinet et d’eau de javel 9° additionné de quelques gouttes d’un mouillant (Tween20) ;

  • Trempage pendant quelques minutes dans l’alcool 95° suivi d’un autre bain de l’eau de javel 9° pendant 15 minutes ;

  • Rinçage avec l’eau distillée stérile (minimum trois rinçages) ;

  • Séchage sous hotte sur papier filtre stérile pendant 10 minutes.

  • Mise en culture dans des tubes à essai remplis d’eau distillée stérile.

Le forçage est assuré par la mise en place des tubes dans une chambre de culture à une température de 28 °C et une photopériode de 16 h /8h de lumière avec une intensité lumineuse de 3000 lux et pendant 10 à 14 jours (Fig.1)