Activités biologiques des huiles essentielles de pins

 

Résumé - Dans le cadre d’un programme de conservation et de valorisation du pin en Tunisie, nous avons entrepris une action de recherche sur les potentielles propriétés antifongiques et herbicides des huiles essentielles de trois espèces de pin : Pinus brutia, Pinus coulteri et Pinus caribaea. En premier lieu, nous avons procédé à l’extraction des huiles essentielles par hydro-distillation des aiguilles et analysé leur composition chimique à l’aide de la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Ensuite, afin d’analyser leurs activités herbicide et antifongique, nous avons réalisé des tests in/ex vitro de culture de champignons et mauvaises herbes soumises à des traitements contenant différentes concentrations d’huiles essentielles. L’analyse de la composition chimique des huiles a révélé que chaque espèce de pin possède des constituants bien spécifiques mais souvent similaires tels que l’α-pinène qui représente le composé commun. Par ailleurs, divers composés sont présents uniquement chez certaines espèces, tels que le manoyl oxide (25,2%) pour P. caribaea et le (E)-calamanène (15,2%) pour P. coulteri. L’étude de l’activité herbicide de ces huiles vis-à-vis des espèces testées (Sinapis arvensis L., Phalaris canariensis L. et Triticum turgidum L.) a montré un effet inhibiteur considérable sur leur germination et leur croissance. L’étude de l’activité antifongique sur différentes espèces phytopathogènes (Fusarium avenaceum, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea et Bipolaris sorokiniana) a révélé que ces huiles inhibent la croissance des champignons, néanmoins cet effet est moins prononcé que l’action herbicide. Ces potentielles activités antifongique et herbicide restent à valider en plein champ ainsi que leur impact sur leur environnement avant de pouvoir suggérer et formuler un bio-pesticide à base d’huiles essentielles de pin.

 

Mots clés : antifongique / herbicide / huile essentielle / pin.

 

1. Introduction

De fortes pressions de sélection sont exercées sur les champignons phytopathogènes ainsi que les mauvaises herbes depuis l’utilisation des premiers pesticides. Elles ont été accentuées depuis les cinquante dernières années par leur utilisation massive. De plus, l’application sur les cultures de fongicides et herbicides à cibles identiques favorise largement l’apparition d’espèces résistantes. Les pesticides inefficaces deviennent alors obsolètes, ne connaissent plus de débouchés commerciaux et perdent peu à peu leur homologation. Leur toxicité pour l’homme découverte lors d’études toxicologiques est aussi un facteur qui a favorisé de nombreux retraits de matières actives (Oerke 2006). La recherche continue de nouveaux produits antifongiques et herbicides reste donc une nécessité à laquelle il faut répondre. L’orientation des travaux vers des bio-pesticides semble également porteuse. La stratégie d’utiliser des bio-molécules à partir de substances végétales peut aussi être intéressante. En effet, certaines huiles essentielles sont pourvues d’activités antibiotiques importantes à large spectre (Dayan et al. 1999; Cakir et al. 2004). La perspective de pouvoir contrôler et/ou réduire l’utilisation de produits chimiques toxiques et généralement polluants est attrayante et conduit au développement de nouvelles stratégies et molécules parfois très avantageuses pour la lutte contre les pathogènes et mauvaises herbes des cultures (Kordali et al. 2007). Dans ce contexte, on se propose d’analyser la composition chimique des huiles essentielles de trois espèces de pin (figure 1) : Pinus brutia, Pinus coulteri et Pinus caribaea ; puis d’effectuer une prospection de leur capacité antifongique et herbicide respectivement sur des champignons phytopathogènes et des mauvaises herbes envahissant les espèces cultivées.

 

Figure 1 : Aspect et taille des cônes de pin à maturité. A: P. caribaea, B: P. brutia et C: P.coulteri. Barre = 3cm.

 

2. Matériel et Méthodes

2.1. Récolte des échantillons et extraction des huiles essentielles

Trois espèces de pin ont été considérées au cours de cette étude : Pinus brutia Ten. (1811), Pinus coulteri et Pinus caribaea Mor. (1851). Les feuilles sont prélevées sur des arbres âgés de 20 ans et provenant de l’arboretum de l’INRGREF de la région de Aïn Draham en décembre 2010. Les échantillons ont subi un séchage pendant quinze jours en serre, avant de passer à l’extraction. Cinq échantillons sont prélevés à partir d’une dizaine d’arbres (choisis au hasard et distants au moins de 5 mètres) et stockés en serre, puis mélangés pour homogénéisation et enfin utilisés en trois répétitions au cours de l’extraction. Cette dernière est réalisée par hydrodistillation à l’aide d’un appareil de type Clevenger durant 3 heures à raison de 100 g de matériel végétal pour 500 ml d’eau distillée. Enfin, les huiles essentielles sont récupérées à l’aide d’une seringue, centrifugées afin d’éliminer les traces d’eau et stockées à une température de 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’au moment de leur utilisation.

 

2.2. Détermination des propriétés physico-chimiques des huiles essentielles

Le rendement est exprimé en gramme d’huile essentielle pour 100 grammes de matériel végétal. Etant donné que l’on utilise un matériel végétal sec, on rapporte le rendement à celui du matériel frais en tenant compte de sa teneur en eau. La densité relative de l’huile essentielle correspond au rapport de la masse d’un volume d’huile essentielle à 20 °C à la masse du même volume en eau distillée à 20 °C. L’indice de réfraction est mesuré à l’aide d’un refractomètre à la température ambiante puis ramené à 20 °C par la formule suivante :

I₂₀ = It + 0,00045 (T - 20 °C)

Avec :

I₂₀ : indice à 20 °C ; It : indice à la température ambiante ou de mesure ; T : Température ambiante ou de mesure.

 

2.3. Analyse chromatographique

L’analyse chromatographique est réalisée à l’aide d’un chromatographe en phase gazeuse (GC-2014 Shimadzu gaz chromatograph), , la température de l’injecteur est 250 °C et celle du détecteur est de 270 °C et la température de la colonne suit le programme suivant : la colonne a une température initiale de 50 °C qui est maintenue pendant 1 minute, puis de 50 °C à 175 °C à raison de 5 °C par minute. La température de 175 °C est maintenue pendant 10 minutes. Ensuite elle passe de 175 °C à 250 °C (15 °C/min). 10 µl d’huile essentielle sont dilués avec 0.1 ml de n-hexane (1 µl injecté). Les composés des huiles essentielles sont identifiés par comparaison des spectres avec une base de données (Adams 2001) et en calculant les indices de rétention. L’identification de molécules pour lesquelles des standards étaient disponibles, a été vérifiée par co-injection et mesure des temps de rétention. La teneur (%) des différents composés identifiés dans une huile essentielle donnée est déterminée par normalisation à 100 %.

 

2.3. Activité herbicide

Matériel végétal

Trois espèces végétales (Sinapis arvensis L. ou moutarde des champs, Phalaris canariensis L. ou alpiste et Triticum turgidum L. subsp. durum (Desf.) Husn. ou blé dur) ont été utilisées pour évaluer le pouvoir phytotoxique des huiles essentielles, en considérant deux stades de culture, germinatif et adulte. Le choix du blé dur et des mauvaises herbes mono et dicotylédones a été guidé par la volonté d’identifier un effet sélectif.

Méthodologie

L’activité herbicide a été évaluée aux stades germinatif et adulte. Cette étude a été effectuée par la méthode de contact direct (Tworkoski 2002). Dans des boites de Pétri, 10 graines sont mises à germer entre deux papiers filtres en présence de 8 ml de solution d’huile essentielle diluée dans l’eau avec le tween 20 (0.1 %), en utilisant les concentrations suivantes : 0, 2.5, 5, 7.5 et 10 µl/ml. Trois répétitions ont été effectuées pour chaque essai. Pour l’étude de la phytotoxicité des huiles essentielles au stade adulte, l’application de l’huile essentielle se fait par pulvérisation avec différentes concentrations d’huile dans une solution eau+ tween 20 (0.1 %) également. Pour cela, nous avons commencé par la culture de quelques herbes (test au stade germinatif) dans des plaquettes dont les alvéoles sont remplies d’un mélange de tourbe, sable et perlite (1/3 de chaque). Quatre semaines après l’émergence des graines, l’activité herbicide de chaque huile essentielle a été évaluée : un lot témoin pulvérisé avec l’eau distillée et trois lots pulvérisés avec trois concentrations différentes d’huile essentielle (40, 80 et 120 µl/ml). Un jour après pulvérisation, les effets phytotoxiques de l’huile à différentes doses on été mesurés en se référant au témoin. Trois répétitions ont été effectuées pour chaque essai.

Paramètres mesurés

-Mesure des produits de peroxydation

Ce paramètre est étudié au niveau des racines au cours du stade germinatif ; le stade adulte ayant été fortement affecté par une toxicité aigüe, n’a pas été considéré. La peroxydation des lipides est estimée par l’évolution de la teneur en malondialdéhyde (MDA), produit de la dégradation oxydative des acides gras polyinsaturés, selon la méthode décrite par Prasad et al. (1995). L’homogénéisation du tissu végétal dans l’acide trichloracétique 0.1 % à raison de 10ml pour 1 g de tissu est suivie d’une centrifugation pendant 10 min à 10000 g à la température de 4 °C. Au surnageant, est ajouté un volume égal d’acide thiobarbiturique (TBA) 0.5 % dans le TCA 20 %. Le mélange est incubé à 100 °C pendant 30 min. L’absorbance du surnageant, obtenu après centrifugation à 10000 g pendant 5 min, est lue à 532 nm. La densité optique est ensuite corrigée par la soustraction de l’absorbance non spécifique à 600 nm. La teneur en MDA est calculée par la formule suivante DO = ε.C.l en utilisant le coefficient d’extinction molaire du MDA (ε = 155 l. mmol^-1. cm^-1).

-La teneur en proline

La teneur en proline a été mesurée selon la méthode décrite par Bates et al. (1973). 100 mg de poudre de matériel végétal ont été digérés dans 3 ml d’acide sulfosalicylique (3 %) pendant 30 min à 100 °C suivie d’une centrifugation à 2000 g pendant 5 min à 25 °C. 0.2ml de l’extrait a été ajouté à 0.4 ml d’eau distillée et 2 ml de mélange de réactif (composé de 30 ml d’acide acétique glacial, 20 ml d’eau distillée et 0.5 g de ninhydrine). Les échantillons ont été mis à ébullition pendant 1 heure puis refroidis et extraits avec 6 ml de toluène. L’absorbance de la phase de toluène a été déterminée à 520 nm et la teneur en proline a été calculée à partir d’une courbe standard et exprimé en mg/g MS.

-La teneur en eau (TE)

La TE est déterminée après séchage des feuilles à 70 °C pendant 72 heures selon la formule suivante :

Ce paramètre a servi pour l’expression du rendement en masse sèche. Trois répétitions ont été effectuées pour chaque essai.

-Appréciation de l’intégrité membranaire

L’intégrité membranaire est étudiée au niveau des racines au cours du stade germinatif et au niveau des parties aériennes au stade adulte selon la méthode de Singh et al. (2008). Ce paramètre a été inclus afin d'avoir une indication sur la stabilité de la membrane et la teneur relative en ions. Les racines de graines germées et les feuilles des plantes adultes ont été lavées avec de l'eau distillée et ont été placés dans des flacons fermés contenant 100 ml d'eau distillée et incubées à 25 °C pendant 2 h, ensuite la conductivité électrique C1 de cette solution a été déterminée à l’aide d’un conductimètre. Les échantillons ont été ensuite autoclavés à 120 °C pendant 20 minutes et la conductivité électrique C2 a été déterminée après stabilisation à 25 °C. La fuite d'électrolytes a été définie comme suit: fuite d’électrolytes (%) = (C1/C2) x100. Trois répétitions ont été effectuées pour chaque essai.

 

2.4. Activité antifongique

L’activité antifongique des huiles essentielles de pin est étudiée par la méthode de contact direct sur milieu PDA (Cakir et al. 2004) sur les souches suivantes : Fusarium avenaceum, Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Botrytis cinerea et Bipolaris sorokiniana, champignons phytopathogènes de différentes espèces cultivées. Trois répétitions ont été effectuées pour chaque essai.

 

2.5. Analyses statistiques

Les valeurs obtenues pour les différents paramètres calculés et mesurés ont fait l’objet d’une analyse de variance (ANOVA) à un facteur en utilisant le logiciel SPSS 17.0. Les moyennes des valeurs annotées d’une même lettre ne sont pas considérées comme différentes selon le test de Student-Newman-Keuls au seuil p ≤ 0.05. Une analyse en composantes principales a été effectuée selon la méthode d’analyse factorielle tenant compte de 10 composés chimiques dont le taux est supérieur à 5 % chez une espèce au moins.

 

3. Résultats

3.1. Propriétés physico-chimiques et composition chimique des huiles essentielles

Caractérisation physico-chimique des huiles essentielles

Les propriétés physico-chimiques de l’huile essentielle constituent un critère d’authentification et d’analyse de leur qualité, elles sont rapportées au tableau 1. En moyenne, l’indice de réfraction est de 1,48. Les 3 espèces possèdent globalement la même densité et le même indice de réfraction. Toutefois le rendement d’extraction de l’huile essentielle de P. brutia (1,1 %) est nettement supérieur à ceux de P. coulteri (0,85 %) et P. caribaea (0,7 %).

 

Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques des huiles essentielles de P. coulteri, P. brutia et P. caribaea.
Espèce	Rendement (%)	Densité (g/ml)	Indice de réfraction	Couleur
P. coulteri	0.85±0.1	0.90	1.49	Jaune pâle
P. brutia	1,1±0.15	0.95	1.47	incolore
P. caribaea	0.70±0.1	0.90	1.48	Jaune pâle

 

 

Composition chimique des huiles essentielles

Les composés identifiés et leurs pourcentages relatifs sont représentés au tableau 2 selon leur indice de rétention. Bien qu’une différence significative soit observée entre les trois espèces, l’α-pinène reste le composé commun. Pour les huiles de P. coulteri, les analyses chromatographiques nous ont permis d’identifier 45 composés représentant 98,3 % de la totalité, avec une richesse spécifique en monoterpènes hydrocarbonés (29,2 %) et sesquiterpènes hydrocarbonés (55,4 %), alors que les monoterpènes et sesquiterpènes oxygénés sont représentés par de faibles teneurs (6,8 et 5,8 % respectivement). En terme de composés majeurs, les huiles de P. coulteri sont caractérisées par leur richesse en : β-caryophyllène (21,3 %), (E)-calamanène (15,2 %), β-pinène (11,3 %), α-pinène (10,8 %) et α-phellandrène (5,1 %). Les analyses chromatographiques ont révélé la présence de 36 composés représentant 97,8 % de la totalité des huiles essentielles de P. brutia particulièrement riches en monoterpènes hydrocarbonés (52,5 %), monoterpènes oxygénés (16,4 %) et sesquiterpènes hydrocarbonés (16 %). Les composés majeurs de l’huile de cette espèce sont: α-pinène (29,1 %), β-pinène (10,5 %), β-caryophyllène (5,3 %) et β-thujone (4,8 %). L’analyse des huiles essentielles de P. caribaea a révélé 36 composés représentant 98,4 % de la totalité de l’huile. Les monoterpènes hydrocarbonés représentent 26 %, les sesquiterpenes hydrocarbonés sont représentés par 35,1 %, alors qu’une richesse particulière et remarquable de cette espèce en diterpènes oxygénés (25,2 %) rend cette espèce différente de P. coulteri et P. brutia. Les composés majeurs de cette espèce sont : le manoyl oxide représenté par 25,2 %, en effet il s’agit du seul diterpène oxygéné détecté dans cette huile expliquant sa richesse en cette fraction, puis le β-caryophyllène (14,4 %), le limonène (12,1 %),le terpinen-4-ol (6,4 %) et l’α-pinène (6,3 %). L’analyse en composante principale des huiles essentielles de ces espèces nous a permis d’extraire deux composantes représentées par l’axe 1 et l’axe 2 de la carte factorielle sur la figure 2. P. caribaea forme un groupe séparé caractérisé par sa richesse en manoyl oxide, limonène et terpinen-4-ol. Un second groupe formé par P. brutia et P. coulteri également divisible en deux sous groupes, le premier, formé par P. brutia, est caractérisé par sa richesse en α et β-pinène et le second, formé par P. coulteri est caractérisé par sa richesse en α et β-pinène, β-caryophyllène et le(E)-calamanène se démarquant ainsi de P. brutia.

 

Tableau 2 : Composition chimique des huiles essentielles extraites à partir des aiguilles de P. coulteri, P. brutia et P. caribaea.
N°	I.R.	Composés %	P. coulteri	P. caribaea	P. brutia	Identification
1	926	tricyclène	0±0	0,2±0	0±0	I.R., SM
2	939	α-pinène	10,8±0,4	6,3±0,3	29,1±1,2	I.R., SM, Co-inj
3	950	α-fenchène	0±0	1,7±0,1	0,2±0	I.R., SM
4	954	camphène	0,6±0	0±0	1,9±0,1	I.R., SM
5	976	β-pinène	11,3±0,5	0±0	10,5±1,1	I.R., SM, Co-inj
6	991	β-myrcène	1±0,1	0,2±0,1	1,4±0,1	I.R., SM
7	1007	α-phellandrène	5,1±0,3	0,1±0	0±0	I.R., SM
8	1011	δ-3-carène	0±0	0±0	2,3±0,2	I.R., SM
9	1021	1,8-cinèole	1,6±0,2	0,1±0	1,8±0,1	I.R., SM, Co-inj
10	1026	p-cymène	0±0	0±0	2,4±0,2	I.R., SM
11	1031	limonène	0±0	12,1±1	3,9±0,3	I.R., SM, Co-inj
12	1037	(Z)-β-ocimène	0,1±0	0,2±0,1	0,1±0	I.R., SM
13	1062	δ-terpinène	0,1±0	0,1±0	0,2±0	I.R., SM
14	1088	α-terpinolène	0,2±0	5±0,3	0,5±0,1	I.R., SM
15	1098	linalool	0,3±0,1	2±0,1	0±0	I.R., SM
16	1115	β-thujone	0±0	0±0	4,8±0,2	I.R., SM, Co-inj
17	1141	(Z)-sabinol	0,2±0	0,1±0	2,8±0,3	I.R., SM
18	1142	camphor	0±0	0±0	2,5±0,2	I.R., SM, Co-inj
19	1149	bornéol	0,5±0,1	0,1±0	0,3±0,1	I.R., SM
20	1176	myrténol	0±0	0±0	1,4±0,2	I.R., SM
21	1179	α-terpinèn-4-ol	0,1±0,1	6,4±0,2	0,5±0,1	I.R., SM
22	1185	cryptone	0±0	0,3±0,1	0±0	I.R., SM, Co-inj
23	1193	dihydrocarvéol	0,2±0,1	0±0	0±0	I.R., SM
24	1196	α-terpinéol	0±0	0±0	1,3±0,2	I.R., SM, Co-inj
25	1197	méthyl chavicol	0,2±0	0±0	0±0	I.R., SM
26	1198	estragole	2,3±0,3	0,1±0	0±0	I.R., SM
27	1205	verbénone	0±0	0±0	2,3±0,2	I.R., SM
28	1235	méthyl thymol éther	0,1±0	0±0	0±0	I.R., SM
29	1279	isobornyl acétate	0,6±0,1	0,1±0	1,3±0,2	I.R., SM
30	1337	α-terpényl acétate	0,8±0,1	0±0	0,2±0	I.R., SM
31	1381	géranyl acétate	0±0	0,3±0,1	0±0	I.R., SM
32	1387	β-cububène	2,7±0,4	0±0	0±0	I.R., SM
33	1388	β-bourbonène	0,2±0,1	0±0	0,2±0,1	I.R., SM
34	1390	β-élemène	2,1±0,3	0±0	0,1±0,1	I.R., SM, Co-inj
35	1398	longifolène	0,6±0,1	0,1±0	4,6±0,6	I.R., SM
36	1403	méthyl eugénol	1,5±0,1	0,2±0,1	0±0	I.R., SM
37	1420	β-caryophyllène	21,3±1,1	14,4±1,3	5,3±0,4	I.R., SM, Co-inj
38	1441	aromadendrène	0,1±0,1	17,2±0,7	0,3±0,1	I.R., SM
39	1448	α-humulène	0,7±0,2	0,1±0	2,5±0,2	I.R., SM, Co-inj
40	1462	dihydroaromandrène	0,1±0	0±0	0±0	I.R., SM
41	1463	canadi,1,4-diène	0,7±0,2	0,2±0	0±0	I.R., SM
42	1477	δ-gurjunène	1,2±0,1	0,1±0	0±0	I.R., SM
43	1478	germacrène D	6,2±0,4	1,8±0,2	0,6±0,1	I.R., SM
44	1484	α-amorphène	0,2±0,1	0,1±0	0±0	I.R., SM
45	1486	β-selinène	1±0,2	0,2±0	0,1±0	I.R., SM
46	1495	bicyclogermacrène	0,2±0	0,2±0,1	0,4±0,1	I.R., SM
47	1499	α-murrolène	0,4±0,1	0±0	0±0	I.R., SM
48	1505	α-farnasène	0,3±0	0±0	0,1±0	I.R., SM
49	1508	b-bisabolène	0,1±0,1	0,2±0	0±0	I.R., SM
50	1521	(E)-calmanène	15,2±0,4	0,1±0	0±0	I.R., SM
51	1524	δ-cadinène	0,1±0	0,2±0	1,8±0,3	I.R., SM
52	1559	nérolidol	0,5±0,1	0,1±0	0±0	I.R., SM
53	1560	β-calacorène	0,6±0,1	0±0	0±0	I.R., SM
54	1576	caryophyllène oxide	0±0	0±0	3,9±0,2	I.R., SM
55	1592	viridiflorol	0±0	0±0	3,8±0,4	I.R., SM
56	1612	tétradecanal	0,3±0,1	0,3±0,1	0±0	I.R., SM
57	1627	tau-murrolol	5,3±0,4	2±0,2	0±0	I.R., SM
58	1938	cembrène	0,2±0,1	0,2±0	0±0	I.R., SM
59	1993	manoyl oxide	0,3±0,1	25,2±3,1	0±0	I.R., SM
60	2044	abiétatriène	0±0	0±0	2,4±0,3	I.R., SM
Identification totale %			98,3	98,4	97,8
Monoterpènes hydrocarbonés %			29,2	26	52,5
Monoterpènes oxygénés %			6,8	9,4	16,4
Sesquiterpènes hydrocarbonés %			55,4	35,1	16
Sesquiterpènes oxygénés %			5,8	2,1	7,7
Diterpènes hydrocarbonés %			0,2	0,2	2,4
Diterpènes oxygénés %			0,3	25,2	0
Autres %			0,3	0,3	0
Les valeurs indiquées représentent une moyenn